2021/04/28

～オンチップ型の人工臓器モデル創製への可能性～

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研究の背景

細胞を3次元に組み上げ、臓器のような高度な生体機能を人工的に再現する技術は、細胞生物学や再生医療、創薬などの分野で需要が高まっています。細胞本来の機能を発現させるためには、細胞を取り巻く環境を生体内に近づけることが重要です。特に細胞の足場となる材料は、3次元的に形状を制御できること、生体内と同様のずり・伸縮刺激を再現できること、成長因子^※7や老廃物といった分子の透過が可能であること、などの条件を満たす必要があると考えられています。こうした要件を満たす材料の一つに、高い生体適合性を示すハイドロゲルがあります。ハイドロゲルは網目状の高分子に大量の水が保持された柔らかい材料であり、臓器や軟骨など私たちの身体と似た物質を透過する性質を示すため、細胞培養の足場材料として広く研究されています。一方で、一般的にハイドロゲルは脆弱で壊れやすく、それ単体でマイクロメートルスケールの微小で複雑な3次元構造や自立した中空構造を作製し、機械的な刺激を加えることは困難とされていました。加えて、水を吸って膨らむ膨潤性のため、この大きな体積変化を固体基板上で支えることが難しいという問題がありました。
近年の加工技術の進展により、ハイドロゲルを3次元構造へと成形する手法が報告されています。しかしながら、血管や腸管のように大きく変形する薄膜管状構造の作製は、技術的に難しく、用いる材料の制約もありました。様々な機能を有する幅広い種類のハイドロゲル薄膜に対して、汎用的に3次元構造へと成形できる手法を確立できれば、高い伸縮性・物質の透過性・生体適合性を持った生体の臓器に類似の構造を作製することが可能となります。生体内を模倣した細胞培養基材として、Organ-on-a-chipや再生医療、創薬スクリーニングなどの応用に繋がることが期待できます。

研究の成果

本研究では、従来、制御が困難であったハイドロゲルの膨潤に着目し、膨潤を逆に利用した構造化手法を考案することで上記の問題を解決しました。伸縮性、物質透過性、生体適合性を有するポリアクリルアミドゲルの薄膜を、ガラス基板上へパターン状に接着し、水中で膨潤させることで座屈剥離に基づく3次元構造を作製しました（図１、動画１）。得られた構造は膨潤度に応じて可逆的に変化させることができます。また、ハイドロゲルとガラス基板の接着パターンは、汎用的なリソグラフィー技術を用いて簡便かつ大面積で制御することが可能です。その一例として、線状の剥離パターンから、ハイドロゲル薄膜が線状に浮き上がった流路構造を作製することに成功しました。この流路構造とポンプを送液チューブで接続し、空気や液体を注入可能な流路型デバイスとして利用できることを実証しました。本デバイスは、ポンプの圧力を調節することで、ハイドロゲル流路の変形挙動を制御することが可能です。さらに、流路内部および外部での長期的な細胞培養にも成功しました。流路内部での細胞培養の成功は、人工的な臓器形成のための鋳型として応用する技術として期待できます。一方、流路の外側にある細胞に対しては、ハイドロゲルの物質透過性を活かして、流路へ薬剤を注入することで、外側にある細胞への局所的な化学刺激を実現しました。

技術のポイント：座屈剥離によるハイドロゲル薄膜の構造化と流体デバイスへの展開

1. 座屈剥離に基づくハイドロゲル薄膜の3次元構造化と制御
   座屈剥離により形成される3次元形状は、剥離パターンやハイドロゲル薄膜の硬さや厚みに応じて形成位置や細かい形状を制御することができます。例えば、剥離パターンをストライプ状やハニカム状に設計すると、直線状または複雑な合流流路を作製することができます（図２(a)）。また、ストライプ状の剥離パターン幅やハイドロゲルの硬さを変化させて、直線、蛇行、2重周期蛇行など、様々な3次元形状に制御可能です（図２(b)）。 　本手法は様々な種類のハイドロゲルに適応することができます。刺激に応じて膨潤度が変化する刺激応答性ゲルを用いると、その3次元構造を外部刺激に応じて動的かつ可逆的に制御できることを実証しました。例えば、電解質に応答して膨潤度が変化するハイドロゲル構造の微細な制御や、温度に応答して膨潤度が変化するハイドロゲル構造のスイッチングに成功しています。（図３、動画２）
2. 流路型デバイスへの展開
   線状の剥離パターンを設計することで、ハイドロゲル薄膜とガラス基板とで囲まれた流路構造を作製することができます。この流路構造へ耐水パテと固定冶具を用いて送液チューブを接続してポンプにつなぐと、圧力で送液可能な流路型デバイスとして動作します（図４(a)）。ここでは、圧力で大変形する薄膜型デバイスと、外側をゲルでさらに被覆して変形量を調節した積層型デバイスの2種類を作製しました（図４(b)）。外から加える圧力を変化させると、大変形や周期的な拍動変形を繰り返す特性を実証し、生体内の変形を模倣できる機能を確認しました（動画３）。
3. 流路内外における細胞の長期培養と薬剤透過による局所刺激
   ハイドロゲルは生体適合性が高いため、流路を足場とした細胞の長期的な培養を可能とします。流路内で筋芽細胞を培養すると、流路の内壁に沿って細胞が3次元的に広がっている様子が観察されました（図５（a）、動画４）。また、前述した積層型デバイス上で筋芽細胞を培養し、流路内へアセチルコリン^※8の薬剤を注入すると、ゲルの物質透過性により薬剤が外側の細胞にまで到達し、局所的に化学刺激ができることを実証しました（図５(b)）。薬剤によって刺激された細胞を蛍光で可視化した結果、流路の直上から波状に刺激されていく様子が観察されました（動画５）。

今後の展開

今回、ガラス基板にパターン状に接着したハイドロゲル薄膜を膨潤させ、座屈剥離に基づく3次元構造を自在に形成する技術を考案しました。さらに、得られた構造をポンプと接続した流体デバイスでは、生体内と類似した変形性と物質の透過性を備えた、生体適合性の高い細胞培養基材として利用できることを示しました。本手法は、幹細胞を用いた再生医療や、薬剤スクリーニングのためのOrgan-on-a-chipへの応用に加えて、バイオデジタルツインの設計に必要な人工臓器モデルの実現に向けた基盤技術に繋がるものと期待されます。

論文掲載情報

著者名：R. Takahashi, H. Miyazako, A. Tanaka, Y. Ueno
タイトル：Dynamic Creation of 3D Hydrogel Architectures via Selective Swelling Programmed by Interfacial Bonding
論文誌名：ACS Applied Materials & Interfaces
掲載日時：2019年6月15日（米国時間）

著者名：R. Takahashi, H. Miyazako, A. Tanaka, Y. Ueno, M. Yamaguchi
タイトル：Tough, Permeable and Biocompatible Microfluidic Devices Formed through the Buckling Delamination of Soft Hydrogel Films
論文誌名：Lab on a Chip
発刊日時：2021年4月6日（英国時間）

行った実験の説明

ガラス基板の表面を接着分子である３－（メタクリロイルオキシ）プロピルトリメトキシシラン^※9で処理することで、ハイドロゲル薄膜と化学的に接着できます。本研究では、リソグラフィー技術でガラス表面の接着分子をパターニングし、その基板上で厚み30~120μｍ程度のポリアクリルアミドゲルを合成しました。接着分子がある場所はガラス基板とハイドロゲルが強固に接着し、接着分子がない場所は簡単に剥離します。その後、ハイドロゲル薄膜を膨潤させると、パターンに応じて剥離しつつ折れ曲がった（座屈）3次元構造へと変形させることができます（座屈剥離）。今回は線状の剥離パターンを用いることで、ハイドロゲル薄膜が浮き上がった流路構造を作製しました。

用語解説

※1 ... ハイドロゲル

ハイドロゲルとは、網目状の高分子の中に大量の水が保持された柔らかい材料です。固体と液体の中間の性質を示し、膨潤による体積変化や分子透過性といった特徴的な性質があります。高い生体適合性を示すため、コンタクトレンズや美容整形での埋め込み材料、細胞培養基材など、医療用やバイオ研究用材料として広く利用されています。

※２ ... Organ-on-a-chip

生体機能チップとも呼ばれ、チップ上に構成された臓器機能を持つ素子を指します。微細加工技術を用いて流路状の足場構造を作製し、その上で臓器の細胞を培養し、臓器機能を発現させます。実験動物や人に頼らずに臨床試験を実施できる技術として期待されており、様々な人工臓器の実現を目指し盛んに研究されています。

※３ ... ポリアクリルアミドゲル

低分子であるアクリルアミドがたくさん（ポリ）つながり、それらが化学的あるいは物理的に絡み合った網目状の構造になり水を保持することでポリアクリルアミドゲルとなります。化粧品や生体埋め込み材料などに広く利用されており、汎用的に用いられるハイドロゲルの一つです。

※４ ... 座屈剥離

薄膜を両端から圧縮することで、中央部が湾曲しながら浮き上がり、アーチ状の構造へと変形します。これが、折れ曲がりながら（座屈）はがれる（剥離）という座屈剥離現象です。

※５ ... 筋芽細胞

筋繊維の由来となる細胞であり、筋芽細胞は単核（核が一つ）の細胞であり、これらが多数集まって融合することで、筋繊維へと分化していきます。

※６ ... バイオデジタルツイン

サイバー空間における、人それぞれの身体および心理の精緻な写像をバイオデジタルツイン（Bio Digital Twin、以下BDT）と呼び、NTT医療健康ビジョンの根幹を支える技術です。

※７ ... 成長因子

増殖因子などとも呼ばれ、動物の体内において特定の細胞の分化の増殖を促進するタンパク質の総称です。器官形成の制御といった独特な生理作用から、再生医療分野やOrgan-on-a-chipにおいて重要な役割を担っています。

※８ ... アセチルコリン

生体内において、神経刺激を伝える神経伝達物質の一つです。骨格筋や心筋などの筋線維にあるアセチルコリンの受容体に働きかけ、筋肉の収縮を促進します。麻酔後の腸管麻痺や急性胃拡張に作用する薬剤としても販売されています。

※９ ... ３－（メタクリロイルオキシ）プロピルトリメトキシシラン

シランカップリング剤と呼ばれる接着分子の一種であり、分子内に有機材料と無機材料のそれぞれと結合する官能基を併せ持っています。今回の研究では、ガラスやシリコンなどに結合する部位と、ハイドロゲルに結合する部位を有する分子を使用しています。

動画リンク先

（動画１）膨潤を駆動力とするハイドロゲル薄膜の座屈剥離現象に関する動画

（動画２）温度応答性ゲルを用いた構造の可逆的なON-OFF制御に関する動画

（動画３）薄膜型デバイスの大変形・周期変形挙動に関する動画

（動画４）ハイドロゲル流路内における細胞培養に関する動画

（動画５）流路内への薬剤注入による細胞への局所的な化学刺激に関する動画